|
Серологическая диагностика
Для серологической диагностики клещевого риккетсиоза могут быть использованы 3 иммунологических теста: реакция связывания комплемента (РСК), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА). Во всех реакциях используют только специфические антигены, приготовленные тем или иным способом из R. sibirica.
В РCK используют растворимый антиген из R.sibirica, в РНГА - полисахаридный комплекс, полученный из них же, в нМФА - корпускулярный антиген, представляющий собой корпускулы R. sibirica. С помощью этих реакций (комплекса их или какой-либо одной) выявляются все заболевания клещевым риккетсиозом, независимо от их клинической выраженности.
Обычно для серологической диагностики достаточно постановки какой-либо одной из перечисленных реакций.
Основанием для постановки диагноза служат результаты реакции, указывающие на появление, 2-4-кратное или более значительное нарастание титров специфических антител в процесce заболевания.
Постановку РНГА осуществляют в бактериологических лабораториях районных, городских СЭС и инфекционных больниц. Возможностью для постановки РСК и нМФА располагают отделы особо опасных инфекций республиканских (краевых, областных) СЭС.
Реакция непрямой гемагглютинации
РНГА заключается во взаимодействии антител, содержащихся в сыворотке, с гомологичным антигеном из R. sibirica, адсорбированным на поверхности эритроцитов барана, в результате чего происходит их агглютинация.
Эта реакция является более чувствительной и технически простой, особенно в случае применения эритроцитарного антигенного диагностикума.
РНГА позволяет выявлять антитела в ранние сроки заболевания. Начиная со 2-й недели антитела определяются в титрах 1:100-1:800, а на 3-й неделе достигают уровня 1:800-1:3200.
Вместе с тем, титры агглютининов, выявленные в РНГА, имеют наиболее резкую тенденцию к снижению и обычно через 7-10 месяцев после болезни уже не выявляются. Поэтому РНГА используют для серодиагностики текущего заболевания клещевым риккетсиозом. При этом рекомендуется использовать свежие сыворотки или сыворотки, сохраняющиеся при -20° С.
Дифференциальная диагностика между родственными в антигенном отношении заболеваниями риккетсиальной этиологии с помощью РНГА не осуществляется.
Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента является вполне специфическим серологическим тестом для диагностики клещевого риккетсиоза. Эту реакцию рекомендуется применять как для текущей, так и ретроспективной диагностики заболевания.
Комплементфиксирующие антитела у большинства заболевших выявляются в крови с начала 2-й недели болезни (с 10-11 дня) в невысоких титрах (1:20-1:80). Максимум накопления антител отмечается на 3-й неделе или в начале 4-й недели заболевания. Уровни их обычно колеблются в пределах 1:160-1:320.
Начиная с 4-й недели уровни комплементфиксирующих антител постепенно снижаются, и в титрах 1:10-1:20 они могут быть обнаружены спустя 3-5 лет после болезни.
С целью дифференцирования текущего заболевания от ранее перенесенного рекомендуется обязательное исследование сывороток крови больного в динамике с интервалом между вторым (первую пробу крови получают сразу же после выявления заболевания) и третьим взятием крови в 5-7 дней в начале болезни (например, на 10-й и 15-й дни) и в 7-10 дней в период реконвалесценции (например, на 16-й и 24-й день). Положительная динамика антител будет свидетельствовать о текущем заболевании. Однако необходимо помнить, что на динамику антител, время их появления и высоту уровней может оказывать угнетающее влияние применение антибиотиков, особенно раннее их применение до 3-4-го дня болезни. В этих случаях первая регистрация антител в низких титрах (1:10-1:20) может быть впервые осуществлена на 3-й неделе болезни и даже позже, а сама динамика их укорочена.
Динамическое наблюдение за результатами РСК необходимо также в связи с возможностью наличия антител к возбудителю клещевого риккетсиоза у лиц, проживающих на эндемичных по этой инфекции территориях, в результате латентной иммунизации в процессе контактов с инфицированными клещами.
Заболевания клещевым риккетсиозом рекомендуется дифференцировать с такими риккетсиозами, как сыпной тиф и лихорадка Ку, проводя исследование сыворотки крови больного параллельно с антигенами из риккетсий Провачека и коксиелл Бернета.
Поскольку на территории Сибири и Дальнего Востока имеются сочетанные природные очаги клещевого риккетсиоза и клещевого энцефалита, целесообразно проводить дифференциальную диагностику с последним, используя соответствующие серологические тесты.
В случае необходимости проведения серологической дифференциальной диагностики между клещевым риккетсиозом и другими представителями родственных заболеваний (например, с везикулезным риккетсиозом или пятнистой лихорадкой) в РСК используют вместо растворимых антигенов соответствующие корпускулярные.
Непрямой метод флуоресцирующих антител
Для выявления антител непрямым методом флуоресцирующих антител на ряд мазков, приготовленных из взвеси корпускулярного антигена R. sibirica, наносят в разведениях, начиная с 1:10, исследуемую сыворотку больного. После выдерживания во влажной камере, промывки и высушивания мазки обрабатывают люминесцирующей сывороткой против сывороточных глобулинов человека. Затем препараты исследуют под люминесцентным микроскопом. Этот метод позволяет выявить не только наличие антител, но и установить их титр в сыворотке. нМФА используют для диагностики текущего заболевания. Исследуемые сыворотки должны быть свежими или сохранявшимися в замороженном состоянии при -20° С. Титры антител, выявляемые в нМФА, с начала 2-й недели болезни находятся в пределах 1:100-1:800, а к концу 3-й недели достигают уровня 1:800-1:3200.
Выявление риккетсий при помощи прямого метода флуоресцирующих антител
Выявление R. sibirica в мазках из различных инфицированных объектов проводится с использованием прямого метода флуоресцирующих антител. При этом можно исследовать препараты, приготовленные из иксодовых клещей, желточных оболочек куриных эмбрионов и культуры ткани, а также мазки-отпечатки из внутренних органов экспериментально зараженных животных.
Для исследования применяются диагностические флуоресцирующие сыворотки к R. sibirica, в которых в качестве флуорохрома использован изотиоцианат флуоресцеина.
Приготовленные препараты высушивают на воздухе и фиксируют в течение 15-20 минут этиловым спиртом или охлажденным ацетоном. Перед окраской флуоресцирующими антителами препарат помещают в чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой, наносят на него каплю флуоресцирующей сыворотки в рабочем разведении, после чего чашку закрывают и выдерживают в течение 15-20 минут при комнатной температуре. Затем каплю флуоресцирующих антител смывают физиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой и высушивают.
Препараты просматривают под люминесцентным микроскопом с использованием иммерсионных объективов. Учет результатов проводят на основе оценки интенсивности специфического свечения риккетсий и их морфологических особенностей.
Достоверными следует считать результаты исследования, когда в мазках наблюдаются ярко флуоресцирующие морфологически типичные риккетсии, расположенные в ядре, цитоплазме пораженных клеток или вне их.
С целью контроля иммунологической специфичности используют следующие контроли: окраску мазков гетерологичными флуоресцирующими сыворотками (Ку-риккетсиальной, сибиреязвенной, туляремийной или другой), окраску мазков карболовым фуксином и синькой.
Для контрастирования неспецифического свечения применяется бычий альбумин, меченый производными родамина.
Выявление риккетсий с использованием иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума в реакции непрямой гемагглютинации
РНГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом позволяет обнаруживать R. sibirica в суспензиях клещей, внутренних органов животных и других инфицированных объектах.
Применяемый для этой реакции стандартный диагностикум, выпускаемый Пермским НИИВС, представляет собой 3-% взвесь формалинизированных эритроцитов барана, обработанных танином и сенсибилизированных лошадиным гаммаглобулином к R. sibirica.
В результате взаимодействия антигена риккетсий с антителами, адсорбированными на поверхности эритроцитов, происходит их агглютинация, которая учитывается по четырехкрестной системе. Титры РНГА при этих исследованиях обычно составляют 1:80-1:160.
Реакцию можно ставить как макрометодом в полистироловых панелях с лунками, так и микрометодом с использованием микротитратора Такачи.
Смотрите далее▪ Клещевой энцефалит ▪ Энцефалит ▪ Эпидемия ▪ Боли в мышцах ▪ Суставах ▪ Ифекция ▪ Возбудитель ▪ Температура ▪ Слабость ▪ Риккетсии ▪ Лаборатория
|
